با ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها مجهز به سیستم
فلورومتری که امکان بررسی و ثبت پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را می‌دهد، Real time PCR ابداع شد. در این روش از کاوشگرها یا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای ‘۵ یا ‘۳ استفاده می‌شود، که امکان بررسی میزان محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازی آنها در روش‌های
الکتروفورز در ژل آگاروز یا ژل پلی آکریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال ۱۹۹۲ کشف شد

. این روش به دلیل کاهش زمان سیکل‌های ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و کاربرد نشانگرهای
فلوروژنیک و روش‌های حساس آشکارسازی تابش آنها باعث افزایش سرعت این سیستم نسبت به
سیستم ‏PCR‏ معمولی شده است. اگرچه این روش دارای معایبی نیز هست.

اصول کار Real time PCR

تمامی اصول و واکنش‌گرهایی که برای یک RT-PCR معمولی نیاز است دراین تکنیک هم بکار می‌رود اما یک گزارشگر فلورسنت نیز در واکنش حضور دارد. این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. با ادامه یافتن PCR شدت فلورسنت رو به افزایش می‌گذارد.
به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی‌دار دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد. به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانه­ای می رسد که به مقدارمشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه ( سیکلی از PCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CT شناخته می شود که
در برخی منابع با عنوان محاسباتCrossing point  مطرح شده است. این مرحله شروع نسخه برداری از قالب است که در نتایج آزمایش استفاده می شود.

بطور کلی Real time pcr چند مرحله دارد

فاز اول the baseline rgion
با وجود اینکه محصول دو رشته ای وجود دارد ولی نور آن قابل ردیابی نیست. فاز دوم The exponential phase ; محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد نمایی مربوط
به واکنش شروع می شود. فاز سوم The liner phase ; ترکیبات واکنش
و کارایی آنها روبه اتمام است. فاز چهارم The plateau phase ; ترکیبات واکنش
از بین می روند و افزایش در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.

در روشReal time PCR واکنش بصورت تک مرحله­ای و یا ۲ مرحله­ای انجام می­شود. در یک مرحله ای از سنتز cDNA و تکثیر آن در یک تیوب انجام می شود. در واکنش ۲ مرحله­ای نسخه برداری معکوس و تکثیر در تیوب های جداگانه صورت می گیرد. در تک مرحله­ای تغییرات آزمایشگاهی به حداقل می رسد ولی حساسیت کمتری دارد. در روش ۲ مرحله­ای هم امکان سنجش قسمت­های مختلف یک DNA هدف وجود دارد
و حذف پرایمر دایمر با دستکاری دمای Annealing آسانتر است گر چه ممکن است شانس آلودگی را بیشتر کند ولی دارای مزیت ها­ی بیشتری نسبت به واکنش تک مرحله ای است (۳، ۴ و ۷).

روش‌های شناسایی در PCR Real time

در سالیان اخیر پیشرفت‌های تکنیکی زیادی اتفاق افتاده و ابزار زیادی در این روش بکار رفته که مهمترین آن شاید اختراع
دستگاه‌های چند کاناله باشد. این دستگاه‌ها قادرند به صورت همزمان چندین طول موج نوری متفاوت را تابانیده و بازتابش آن را ثبت نمایند. دراین تکنیک ، برای تعیین غلظت DNA از رنگ­های فلورسانس و یا شاخص های الیگونوکلئوتیدی
فلورسانس استفاده میشودکه به برخی از مهمترین آنها اشاره می­شود:

رنگ­های فلورسنت متصل شونده به DNA

شاید متداولترین رنگ مورد استفاده در این تکنیک سایبرگرین I باشد. این رنگ اینترکاله و
فلورسنت، به شیارهای کوچک DNA دورشته‌ای متصل می‌شود و با جذب طول موج ۴۹۸ نانومتر، نور ۵۲۲ نانومتری را ساطع می‌کند که توسط دستگاه ثبت می‌شود. سایبرگرین I به الگوهای تک رشته‌ای متصل نمی‌شود لذا در این موارد بازتاب ضعیفی دارد. در طی چرخه های PCR که محصول دو رشته ای تولید می­شود، رنگ به آنها متصل می شود و بنابراین افزایش شدت فلورسنت با غلظت dsDNA متناسب
است. سایبرگرین I یک رنگ غیر اختصاصی است لذا برای تمامی آزمایشات قابل استفاده است
و این مسئله یک مزیت به شمار می‌آید. از دیگر مزایای این رنگ می‌توان به ارزانی، عدم تداخل با پلیمرازها، ساده
و غیر سمی بودن آن اشاره کرد. همانگونه که گفتیم این رنگ غیر اختصاصی است و این
مزیت، مهمترین عیب آن را نیز شامل می‌شود چرا که نمی‌توان وجود محصولات غیر
اختصاصی یا پرایمر دایمر را به کمک این رنگ شناسایی کرد. البته استفاده از نمودار منحنی ذوب
در دستگاه‌های امروزی این مشکل را تا حدودی مرتفع کرده است.

پروب‌های فلورسنت

پروب‌ها بر خلاف سایبرگرین I بر اساس تشخیص اختصاصی توالی محصول کار می‌کنند. پروب‌ها معمولاً
یک رنگ فلورسنس‌زا (Reporter) و یک رنگ خاموش کننده (Quencher) دارند. معمولاً دستگاه‌ها بازتابش رنگ
فلورنس‌زا را بررسی می‌نمایند حضور خاموش کننده در نزدیکی موقعیت فلورسنس‌زا موجب
جذب نور آن و خاموش شدن آن می‌شود لذا در این حالت بازتابشی در دستگاه ثبت نمی‌شود.
از این پروب ها در روشهای زیر استفاده می شود.

Hydrolysis probe

نمونه بارز این روش پروب­های Taqman هستند همچنین این روش به عنوان سنجش’۵ نوکلئازی نیز
شناخته می شود. پروب فلورسنت هیدرولیز شده ودر نتیجه در محصول PCR
تشخیص داده می شود. پروب با ترادف اختصاصی با رنگ گزارش دهنده (reporter) در انتهای’۵ و خاموش کننده (quencher) در انتهای ‘۳ قرار داده می شود. روش استفاده از پروب­های TaqMan بر دو حقیقت استوار است اول آن که از یک آنزیم DNA پلیمراز با ویژگی اگزونوکلئازی ‘۵ به ‘ ۳ استفاده شود و دیگر این که پروب‌ اولیگونوکلئوتیدی حاوی دو نشان رنگی(یکی فلورسنس‌زا و دیگری خاموش کننده) است و تنها زمانی سیگنال می‌دهد که با
فعالیت اگزونوکلئازی شکسته شود. پروب مورد نظر از طریق توالی اختصاصی به محصولات
متصل می‌شود.

Hybridization probe

در اینجا دو پروب وجود دارد یک پروب با یک فلورفور دهنده و پروب دیگر با یک رنگ گیرنده در اتصال است. در حین واکنش PCR پروب ها طوری به الگو هیبرید می شوند که از سر دم در اتصال قرار می گیرند. در این جهت
انرژی پروب دهنده رنگ پروب گیرنده را تحریک می کند که منجر به ساطع شدن نور با طول موج بالاتری می شود. نسبت بین فلورسنس دهنده به فلورسنس گیرنده در طول واکنش افزایش می یابد که متناسب با DNA تکثیری است، اگر DNA تکثیر نشود هیچ نوری قابل ساطع نیست زیرا پروب ها به DNA متصل نشده اند.

پروب­های
با ساختار سنجاق سری (Hairpin probe)

بی‌کون‌های مولکولی (Molecular beacons)

ساده­ترین پروب­های سنجاق سری هستند که شامل یک ناحیه با ترادف اختصاصی (ناحیه لوپ) که دو طرف آن
توالی­های معکوس تکراری وجود دارد. رنگ­های Reporter و quencher به دو انتهای مولکول متصل می­شوند. این دو وقتی با هم در تماس هستند، انرژی انتقالی رزنانسی آنها کاهش می­یابد. پروب­ها با ساختار سنجاق سری
منجر به اختصاصیت بیشتر نسبت به پروب­های خطی می­شوند. کمپلکس Probe-Target باید از لحاظ
ترمودینامیکی پایداری بیشتری نسبت به ساختار سنجاق سری پروب به تنهایی داشته
باشند. زیرا در کمپلکس Probe-Target ترکیب پایدارتری با استفاده از همولوژی بازها تشکیل می­شود. این ویژگی به خصوص در تشخیص آلل­ها بکار می­رود. مهمترین مزیت بی‌کن‌های مولکولی این است که در جریان واکنش دست نخورده
باقی می‌مانند و در چرخه‌های بعدی مجدداً هیبرید می‌شوند. میزان تشعشع فلورسنس در مرحلۀ هیبریداسیون، با غلظت ژن هدف متناسب است .

اِسکورپیون‌ها (Scorpions)

شکل آزاد پروب‌های اِسکورپیون با بی‌کون مولکولی در محلول شباهت دارد و ساختار سنجاق سری تشکیل می‌دهند با این تفاوت که یکی از پرایمرهای تکثیری با اتصال کوالانت به توالی پروب متصل شده است. بر خلاف بی‌کون‌های
مولکولی، ساختار سنجاق سری اِسکورپیون به انتهای ‘۵ پرایمر اختصاصی متصل می‌شود.
بعد از مرحلۀ گسترش و در دور دوم دناتوره شدن، ساختار سنجاق سری باز می‌شود و به
پروبی دارای توالی اختصاصی اجازه می‌دهد که به عقب خم شده و با توالی هدف در محصولPCR
هیبرید شود. باز شدن حلقۀ سنجاق سر از خاموش شدن گزارشگر جلوگیری می‌کند و فلورسنس افزایش می‌یابد.

منحنی ذوب

برای اینکه بفهمیم PCR درست کار کرده است باید از منحنی ذوب استفاده کنیم. به این ترتیب که از دمای پایین تر از دمای اتصال تا دمای بالاتر از ۹۵ درجه سانتی گراد را در نظر گرفته و برنامه مربوط به آن را به دستگاه می دهیم، تا به ازای هر نیم درجه سانتی گراد لامپ روشن شود و شدت جذب فلورسنت را قرائت کند این باعث می شود که برای تمام قطعات تکثیر شده پیک جذب رسم شود. به این ترتیب در صورت وجود آلودگی از طریق دیدن پیک جذب آن را شناسایی می کنیم. در دمایی پایین پیک های که رسم می شود مربوط به دایمر آغازگر است و آخرین پیک مربوط به قطعه مورد
نظر ماست.

آنالیزهای کمی در Real Time PCR

دو روش عمده برای بررسی کمی در time PCR Real وجود دارد.

روش منحنی استاندارد (مقایسۀ مطلق)

در این روش از نمونۀ RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (nm260) تعیین می‌شود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های
آن تبدیل می‌شود. استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است هرچند که بسیار گران قیمتند. از نمونه های استاندارد سری رقعت تعیین کرده و همراه با نمونه هدف در دستگاه Real-time PCR قرار
می دهیم با استفاده از Ct که دستگاه برای هر رقت به ما می دهد یک منحنی رسم کرده که X آن رقت یا تعداد کپی از ژن و Y آن CT باشد، نمودار به دست امده یک نمودار خطی است که با قرار دادن عدد نمونه هدف در نمودار غلظت یا
تعداد کپی آن نیز بدست می آید. ترجیحا طول قطعه استاندارد مساوی با طول قطعه هدف باشد.

روش آستانه نسبی (مقایسۀ نسبی)

برای حذف نوسانات مقادیر RNA وارد شده در واکنش و خطاهای عملکرد دستگاه‌ها و فرد از استانداردهای داخلی استفاده می‌شود. این استانداردها باید در همۀ بافت‌ها بیان ثابت داشته باشند و آزمایش ما نباید بیان آن را نسبت به
نمونۀ کنترل تغییر دهد. بدین منظور از ژن بتا اکتین و GAPDH استفاده می‌شود. به این ژن‌ها Housekeeping گویند. بیان این ژن ها ثابت است که با مقایسه نمونه تیمار شده با شاهد و کنترل داخلی می توان کاهش یا افزایش بیان را
مشاهده کرد.

تشخیص پلی مرفیسم توسط Real time PCR

استفاده از این تکنیک اجازه تعیین کمیت نواحی چند شکلی
DNA و یا تعیین ژنوتیپ پلی­مرفیسم یک نقطه­ای SNPS) Single nucleotide polymorphism,) جدید را به ما می دهد. مانیتور کردن همزمان پروسه تکثیر و تعیین ژنوتیپ با استفاده از هیبریداسیون پروبها و با آنالیز
منحنی ذوب امکان پذیر می شود. موتاسیون نقطه­ای بوسیله آنالیز منحنی ذوب تشخیص داده
می­شود. دمای بحرانی Tm که در آن DNA تک رشته­ای می­شود یک شناساگر برای وجود یا عدم وجود موتاسیون می­باشد.
پروب اختصاصی برای ناحیه موتانت تهیه می شود در دمای پایین پروب به ناحیه های غیر اختصاصی متصل می گردد و با افزایش دما پروب اختصاصی تر عمل می کند، منحنی ذوب حاصل از این واکنش را آنالیز می کنیم تا متوجه وجود یا عدم وجود موتاسیون شویم

نتیجه گیری

قبل از اندازه‌گیری کمی باید کارایی PCR سنجیده شود. کیفیت و طراحی پرایمرها مهمترین عامل اثر گذار بر
کارایی PCR است. علاوه بر آن نوع دستگاه، نوع کیت مصرفی، پروتکل آزمایش نیز بر کارایی PCR اثر می­گذارند. بدلیل اینکه امروزه روش Real time PCR یک روش معمول در برآورد میزان بیان ژن است این مطلب
ضروری است که استفاده کنندگان از جنبه­های مختلف این روش آگاهی داشته باشند و در صورتی­که
شرایط مختلف این روش کنترل شونده باشند یکی از بهترین روش­های آزمایشگاهی با حساسیت
بالا، کارا، سریع و تکرار پذیر در تعیین میزان بیان ژن­های مختلف است

نویسنده: مهندس ابوذر قربانی –