پایه اساسی آزمون الایزا براساس واكنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن می‌باشد. در آزمون‌های الایزا یك آنتی‌بادی اختصاصی با یك آنتی‌ژن مشخص واكنش داده و سپس با استفاده از یك آنتی‌بادی اتصال یافته با یك آنزیم بعنوان سیستم نشانگر، آزمون ادامه یافته و درنهایت با افزودن سوبسترای آنزیم و تبدیل سوبسترا به محصول كه یك مادة رنگی می‌باشد آزمون الایزا به پایان می‌رسد طول موج رنگ بدست آمده كه نشانگر حضور یك آنتی‌بادی (و یا آنتی‌ژن) و نیز غلظت آن می‌باشد توسط یك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌گردد.
بعنوان مثال در یكی از رایج‌ترین روشهای الایزا ( روش غیر مستقیم) كه برای شناسایی حضور و یا عدم حضور آنتی‌بادی برعلیه یك آنتی‌ژن موردنظر بكار می‌رود ابتدا یك آنتی‌ژن برروی سطح جامد پوشش داده می‌شود سپس نمونة مجهول كه حضور و یا عدم حضور آنتی‌بادی برعلیه این آنتی‌ژن درون آن مورد بررسی قرار می‌گیرد بر روی این سطح جامد پوشش داده شده با آنتی‌ژن, افزوده می‌شود. پس از آن آنتی‌بادی ثانویه یا درحقیقت آنتی‌بادی برعلیه این آنتی‌بادی اولیه كه متصل به آنزیم نیز می‌باشد افزوده می‌شود و در نهایت سوبسترای آنزیم در اختیار آنزیم قرار داده می‌شود و پس از گذشت مدت زمان لازم واكنش آنزیمی خاتمه داده شده و رنگ بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت می‌شود.
-2-1 مراحل یك آزمون الایزا
مراحل انجام یك آزمون الایزا به‌صورت زیر می‌باشد:
1) جذب یك آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی به سطوح جامد پلاستیكی كه اصطلاحا پوشش‌دهی نامیده می‌شود.
2) افزودن نمونه‌های مورد آزمایش
3) انكوباسیون واكنشگرها برای دراختیاز قراردادن مدت زمان كافی برای انجام واكنش
4) جدا نمودن واكنشگرهای متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهای آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو
5) افزودن عوامل متصل شده با آنزیم
6) انكوباسیون واكنشگرها برای دراختیار قراردادن مدت زمان كافی برای انجام واكنش
7) جدا نمودن واكنشگرهای متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهای آزاد و متصل نشده با استفاده عمل شستشو
8) افزودن سوبسترای آنزیم جهت تشخیص واكنش دهنده‌ها
9) انكوباسیون واكنشگرها برای دراختیار قراردادن مدت زمان كافی برای انجام واكنش
10) خاتمه دادن واكنش آنزیمی توسط متوقف كننده‌ها و قرائت دانسیتة نوری بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر
شرح مراحل فوق در ادامه آمده است:
3-2-2 فاز جامد
امروزه بیشتر از پلیت‌های 96 خانه‌ای بعنوان فاز جامد استفاده می‌شود. انواع انعطاف‌پذیر و جداشدنی از پلی‌وینیل كراید و انواع سخت و محكم از پلی‌استیرن ساخته می‌شوند. هم اكنون شركت‌های معتبر و متعددی به‌ساخت انواع مختلف پلیت‌های الایزا مشغول هستند دربعضی از انواع این پلیت‌ها، كف چاهك‌ها صاف و تخت بوده و بعضی دیگر مقعر می‌باشند.
بعضی از پلیت‌ها دارای خاصیت چسبندگی بالا بوده و بعضی دارای چسبندگی متوسط می‌باشند. امروزه آزمایشهای متعددی با موفقیت با هر كدام از این نوع پلیت‌ها انجام می‌شود و نمی‌توان گفت كه قطعا كدام نوع پلیت برتری بر دیگر انواع پلیت‌ها دارد. می‌توان با انجام دو آزمایش الایزای كاملا یكسان كه تنها در نوع پلیت متفاوتند و بررسی نتایج تشخیص داد كه برای كدام نوع از آنتی‌ژن، كدام پلیت بهتر است. بطور كلی پلیت‌هایی كه انتهای چاهك‌های آنها تخت می‌باشد توصیه می‌شود.
3-2-3 پوشش‌دهی
این مرحله كه یكی از مهمترین مراحل آزمون الایزا می‌باشد عبارتست از اتصال پروتئین آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی بر روی پلیت ,درون چاهك های یك پلیت 96 خانه‌ای, كه عمدتا براساس واكنش های آبگریز مابین ماتریكس پلاستیكی و پروتئین می‌باشد. بنابراین هر پروتئین یك ثابت اتصال متفاوتی با پلیت‌ها دارد. این واكنش بستگی به بار خالص پروتئین ندارد.
بنابراین افزودن هیدروفوبیسیتة واكنش پروتئین – پلیت موجب بروز این نواحی هیدروفوب در پروتئین‌ها شده و واكنش مابین پلیت و پروتئین را مستحكم تر می نماید، این دناتوره نمودن جزیی پروتئین‌ها توسط قراردادن پروتئین در معرض دترژنت‌های ملایم و مواد دارای pH پائین حاصل می‌شود كه بعد از این مجاورت می‌توان با استفاده از یك روش دیالیز مناسب، بافر پوشش‌دهی را با این مواد دناتوره كننده تعویض نمود.
عمل پوشش‌دهی به عوامل زیر بستگی دارد.
الف) مدت زمان پوشش‌دهی
ب) دما
ج) غلظت پروتئین‌هایی كه باید پوشش داده شوند.
د) نسبت سطح چاهك‌ها به حجم محلول پوشش دهی
هـ) ضریب انتشار مولكولهای پروتئینی درون محلول پوشش‌دهی درون چاهك‌ها
عوامل فوق یكپارچه بوده و جدای از یكدیگر نیستند. یكی از مهمترین موارد بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئین برای اتصال مناسب به پلیت می‌باشد كه از طریق تیتراسیون پروتئین بدست می‌آید.
محدودة 1 تا 10 μg/ml در حجم 50μl یك راهنمایی خوبی برای بدست آوردن غلظت مناسب اغلب پروتئین‌ها جهت اتصال خوب به پلیت می‌باشد البته این محدوده وابستگی به خلوص نسبی پروتئین موردنظر جهت پوشش‌دهی دارد بنابراین غلظت یك پروتئین جهت پوشش‌دهی وابسته به فعالیت آن پروتئین می‌باشد مشخص است كه یك محلول پروتئینی كه دارای مقدار كمی از پروتئین موردنظر باشد مقدار اتصال آن پروتئین به پلیت برطبق نسبت حضور آن پروتئین در محلول كم می‌باشد و ناخالصی‌های موجود در محلول پروتئینی سطوحی را كه باید پروتئین موردنظر ما در اختیار داشته باشد اشغال می‌نمایند كه در نهایت منجر به یك اندازه‌گیری ضعیف می‌شود.
با استفاده از چند تست الایزا كه در آنها غلظت پروتئین موردنظر برای پوشش‌دهی متفاوت است می‌توان به یك غلظت مناسب از پروتئین جهت پوشش دادن دست یافت. توجه به این مطلب مهم است كه دانسیتة اتصال پروتئین به پلیت درنتیجة نهایی بسیار مهم است. اتصال با دانسیتة بالا حتی ممكن اسب برخلاف انتظار ما به نتایج ضعیف منجر شود چرا كه این دانسیتة بالا می‌تواند از لحاظ قضایی اجازة نزدیك شدن پروتئین دوم (آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی) را به پروتئین پوشش داده شده ندهد. درحقیقت مولكولهای پروتئین پوشش داده شده آنقدر باشدت و استحكام بالایی (و بینابین یكدیگر) به سطح چاهك متصل شده‌اند كه حتی جایگاه‌های اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئین دوم (فرضا آنتی‌بادی) نمی‌باشد.
غلظت‌های بالای پروتئینی كه باید پوشش داده شود نیز منجر به‌همین مسئله می‌شود. رابطه غلظت یك آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی با چگالی نوری (OD) بدست آمده در مرحلة نهایی تست الایزا یك رابطة خطی صرف نمی‌باشد و برای هر پروتئینی بسته به فرم فضایی آن پروتئین و نیز در هر محدوده‌ای از غلظت‌های مختلف آن پروتئین متفاوت می‌باشد.
میزان هیدروفوبیسیتة واكنش پروتئین – پلیت وابسته به دما نیز می‌باشد افزایش دما موجب افزایش این هیدروفوبیسته می‌شود و دانستیم كه این افزایش منجر به اتصال مستحكم تر پروتئین به پلیت می شود یكی از رایج‌ترین روشهای پوشش‌دهی از لحاظ دما، در مجاورت قراردادن پلیت با پروتئین در دمای 37°c می باشد كه در این دما بین 1 تا 3 ساعت زمان مناسبی برای اغلب پروتئین ها می‌باشد در مرتبة بعد می‌توان روش پوشش‌دهی در طول شب در 4°c و یا تركیبی از ایندو را بكار گرفت.
بسته به ماهیت پروتئین‌ها، گاهی اوقات پوشش‌دهی در دمای آزمایشگاه با مدت زمان طولانی‌تر موردنظر قرار می‌گیرد.
البته مشخص است كه افزایش دما در مدت زمان طولانی ممكن است باعث تغییراتی در ساختار پروتئین موردنظر جهت اتصال به پلیت شود. تكان دادن یكنواخت، آرام و منظم پلیت نیز می‌تواند با افزایش میزان برخورد و درنتیجه اتصال پروتئین به پلیت، زمان موردنظر برای پوشش‌دهی را كاهش دهد.
3-2-3-1 بافر پوشش‌دهی
بیشترین بافرهایی كه هم‌اكنون مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :
بافر كربنات 6/9 = pH با كربنات 50 میلی مولار،
Tris – Hcl بیست میلی مولار با pH = 8/5 و یا
PBS 10 میلی مولار با pH = 7/2
اغلب روشهای الایزا از یكی از این سه نوع بافر استفاده می‌نمایند.
بافرهایی غیر از موارد فوق هنگامی مورد استفاده قرار می‌گیرند كه مشكلی در پوشش‌دهی با بافرهای فوق بوجود آمده باشد. از لحاظ تئوری بهترین بافری كه مورد استفاده قرار می گیرد بافری است كه دارای pH برابر با 1 تا 2 واحد بالاتر از (PI) پروتئین اتصالی باشد. اما درعمل اندازه‌گیری این مطلب آسان نمی‌باشد چراكه پروتئین اتصالی (فرضا آنتی‌ژن) حاوی مخلوطی از پپتیدهای متفاوت می‌باشد. با انجام چند آزمایش الایزا كه pHهای متفاوت و قدرت یونی متفاوتی در بافر پوشش‌دهی داشته باشد می‌توانیم اتصال بهتر و مناسب‌تر پروتئین به پلیت را بدست آوریم.
پروتئین های با خاصیت اسیدی، احتیاج به یك pH پائین تر جهت خنثی نمودن نیروی دافعه مابین پروتئین و پلیت دارند و در آزمایشی جهت پوشش دادن پروتئین های ویروس Herpes simplex كه خاصیت اسیدی دارند بهترین pH در محدودة 5/2 تا 6/4 بدست آمده است.
در روش های رایج امروزی پوشش دادن با بافر PBS یا كربنات اغلب موفقیت‌آمیز است.
گاهی اوقات بعضی از آنتی‌ژن‌ها مشكلاتی را در پوشش‌دهی بوجود می‌آورند این آنتی‌ژن‌ها شامل پلی‌ساكاریدها لیپوپلی‌ساكاریدها و گلیكولیپیدها هستند كه پوشش‌دهی مستقیم را منجر به نتایج ضعیف و نامناسب می‌نمایند در اینگونه موارد یك پوشش‌دهی ابتدایی موردنیاز است كه با یك آنتی‌سرم اختصاصی انجام می‌شود كه یك حالت ساندویچی را بوجود می‌آورد كه در ادامة همین فصل توضیح داده خواهد شد.
بنابراین مخلوط تخلیص نشده آنتی‌ژن‌ها مناسب برای پوشش‌دهی مستقیم نمی‌باشد و درصورت نیاز از الایزای ساندویچی استفاده می‌شود.
بدلیل ماهیت غیر كووالانسی اتصالی پروتئین به پلیت، جداشدن یك پروتئین از پلیت نیز ممكن است رخ دهد اما اگر شرایط پایدار و استاندارد باشد این مطلب تأثیر مهمی در یك آزمون الایزا نخواهد گذاشت.