دستگاه اسپکتروفتومتر چیست؟ / کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر در آزمایشگاه

 

اسپکتوفتومتر وسیله ای برای اندازه گیری میزان فوتون های (شدت نور) جذب شده است بعد از اینکه از محلول ساده رد می شود. با اسپکتوفتومتر میزان شناخته شده ای از ماده شیمیایی (غلظت) با سنجش شدت نور یافت شده تعیین می شود.

اسپکتروفتومتر یا طیف سنچ دستگاهی است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. این دستگاه روش تجزیه دستگاهی است که در آن تابش الکترومغناطیسی در ناحیه مرئی و ماورابنفش جذب ماده می شود و از روی شدت جذب مقدار ماده تعیین می شود.

منبع تابش نورسفید بر روی نمونه گازی، جامد یا مایع است و تجزیه گر منشور یا شبکه است. در این روش با استفاده از میزان جذب نور تعیین غلظت می کند. با استفاده از این وسیله امکان اندازه گیری نمونه های فوق العاده کوچک را دارد که از آن برای تجزیه و تحلیل عناصر مولکولی مانند دی ان ای و آر ان ای استفاده می شود. اسپکتروفتومتر دستگاه پیچیده ای است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند.

بسته به طیف طول موج منبع نوری می تواند در دو دسته طبقه بندی شوند:

اسپکتوفتومتر یو وی (UV) از نور در طیف فرابنفش (۱۸۵ تا ۴۰۰نانومتر) و طیف نور مریی (۴۰۰ تا ۷۰۰ نانومتر) در طیف تششع الکترومغناطیسی استفاده می کند

اسپکتوفتومتر IR از طیف نور مادون قرمز (۷۰۰ تا ۱۵۰۰۰ نانومتر) در طیف تششع الکترومغناطیسی استفاده می کند.

در اسپکتوفتومتری مریی، جذب یا انتقال ماده می تواند به وسیله رنگ مشاهده شده تعیین شود. برای نمونه محلولی که نور را در بالاتر از طیف مریی است و هیچ طول موج مریی را عبور نمی دهد به طور تئوری به رنگ سیاه است.

از سویی دیگر اگر همه طول مرئی را عبور دهد و هیچ نوری را جذب نمی کند نمونه محلول به رنگ سفید است. اگر نمونه محلول رنگ قرمز را جذب کند برابر با ۷۰۰ نانومتر به رنگ سبز طاهر می شود چون سبز رنگ مکمل قرمز است.

اسپکتوفتومتر های مریی در عمل از منشوری برای خرد کردن طیف معینی از طول موج استفاده می کنند (فیلتر امواج نوری دیگر) به همین دلیل شعاع ویژه ای از نور از طریق نمونه محلول عبور می کند.

 

 

 

 

اسپکتروفتومتر روشی برای اندازه گیری این است که چه مقدار ماده شیمیایی نور را جذب می کند با سنجش شدت نور چون پرتو نور از طریق محلول نمونه عبور می کند.

این مفهومی کلیدی است که هر ترکیبی نور را از طریق طیف معینی از طول موج جذب یا پراکنده می شوند. این اندازه گیری برای سنجش میزانی ماده شناخته شده به کار می رود.

اسپکتروفتومتری یکی از مفیدترین روش های آنالیز کیفی در زمینه های مختلف مانند شیمی، فیزیک، بیوشیمی، مهندسی مواد، مهندسی شیمی و کاربردهای شیمیایی است.

 

 

اجزا دستگاه:

 

شش قسمت اصلی در ساختمان اسپکتروفتومترها وجود دارد که عبارتند از:

۱) منبع نور

۲) مونوکروماتور

۳) متمرکز کننده پرتو

۴) محل نمونه

۵) آشکارساز

۶) دستگاه نمایش خروجی

 

۱) منبع نور:

 

منبع نور در اثر افزایش حرارت به کمک الکتریسیته در یک لامپ تامین می شود شرایط اصلی این منبع شدت کافی، پایداری و پیوستگی اجزاء آن است. برای تامین نور مرئی از لامپ های تنگستن (با طول موج تولیدی بین ‏nm‏ ۹۰۰-۳۳۰) استفاده می شود. برای تولید پرتوهای فرابنفش از لامپهای هیدروژنی یا دوتریومی (با طول موج nm 450 -200) بهره گرفته می شود.

 

۲) تکفام ساز (‏‎(Monochromator:

 

این قسمت دستگاه پرتو چند فام را به پرتو تکفام تبدیل می کند این عمل ممکن است توسط منشور یا سیستم گریتینگ انجام شود. فیلترها شیشه های رنگی هستند که بخش اعظم پرتوها را جذب کرده و فقط طول موج های محدودی را عبور می دهند. فیلترها باید پرتویی را که آنالیت جذب می کند از خود عبور دهند. منشورها و سیستم گریتینگ بر اساس اختلاف ضریب شکست می توانند طول موجهایی حتی با پهنای ۱/۰ نانومتر تولید کنند. سیستم گریتینگ در اصل یک صفحه صیقلی است که تعداد زیادی خطوط نازک و موازی بر روی آن حک شده و کار منشور را به نحو بهتری انجام می دهد.

 

۳) متمرکز کننده پرتو (Focusing device):

 

با ترکیبی از عدسی ها شکاف بین دو تیغه باریک فلزی و آیینه ها در مسیر پرتو تابش پرتوها مواز ی می شوند و با تنظیم عرض شکاف می توان عرض پرتو را تنظیم کرد. هر قدر عرض شکاف نور بکار رفته کمتر باشد کیفیت پرتوها بهتر خواهد بود.

 

۴) محل نمونه:

 

کووتها (Cuvet) قسمتی از دستگاه هستند که نمونه مورد نظر یا بلانک در آن قرار می گیرد این بخش معمولا به صورت استوانه ای یا مستطیلی بوده از شیشه کوارتز یا پلاستیک ساخته شده است.

کووتهای پلاستیکی و شیشه ای برای محدوده مرئی بکار می روند. به دلیل جذب پرتوهای با طول موج کمتر از ۳۵۰ نانومتر توسط کووتهای شیشه ای برای محدوده فرابنفش از کووتهای گران قیمت کوارتزی یا سیلیسی استفاده می شود.

 

۵) آشکارسازها (Detectors):

 

آشکارسازها دستگاههایی هستند که یک نوع از انرژی را به نوع دیگری تبدیل می کنند و معمولا به سه گروه اصلی تقسیم می شوند: ۱- فتوالکتریکی ۲- فتوشیمیایی ۳- حرارتی. در دستگاههای اسپکتروفتومتر از آشکارسازهای فتوالکتریکی استفاده می شود. فتوسل و فتوتیوب از ساده ترین آشکارسازها می باشند.

فتوترانزیستورها و فتودیودها نیز برای این منظور استفاده می شوند. برای اندازه گیری نورهای ضعیف از (Photomultiplier Tubes) PMT بهره گرفته می شود. PMTها سریعتر جواب می دهند وعلاوه بر حساسیت بالا با دوام تر از سایر آشکارسازها می باشند.

 

۶) دستگاه نمایش خروجی

 

این قسمت می تواند یک گالوانومتر صفحه ثبات اسیلوسکوپ یا صفحه نمایشگر کامپیوتر با نرم افزارهای متنوع باشد.

 

 

نحوه عملکرد دستگاه اسپکتروفتومتر :

اسپکتروفتومترها دارای دو نوع منبع نور جهت تولید نور می باشند که از لامپ تنگستن یا هالوژن برای تولید نور مرئی Vis و مادون قرمز با طول موج ۳۲۰ تا ۱۱۰۰ نانومتر و از لامپ دوترییوم برای تولید امواج ماوراء بنفش UV با طول موج ۱۹۰ تا ۳۲۰ نانومتر استفاده می کنند.

نور تولید شده در ادامه مسیر با استفاده از مونوکروماتور یا تک رنگ ساز فیلتر شده و در طول مسیر با استفاده از چند منشور و توری پراش، طول موج خاصی انتخاب می شود. نور با طول موج خاص انتخاب شده از شکاف عبور یا متمرکز کننده پرتو عبور می کند.

سپس نور مذکور در داخل سل هولدر به کووت رسیده و از نمونه عبور می کند.
قسمتی از نور مذکور در داخل نمونه جذب و مابقی عبور می کند. نور عبوری به دتکتور یا آشکارساز رسیده و پس از تعیین شدت نور و تبدیل آن به انرژی الکتریکی توسط صفحه نمایشگر نشان داده می شود.

 

 

 

در هنگام استفاده از اسپکتروتومتر نکات ذیل را باید رعایت کنیم:

دستگاه اسپکتروفتومتر باید روی یک سکو با سطح صاف و بدون شیب و بالاتر از سطح زمین قرار گیرد.
دستگاه اسپکتروفتومتر نباید در نزدیکی دستگاه هایی که امواج الکترومغناطیس و امواج الکتریکی شدید تولید می کنند، قرار گیرد.

در هنگام راه اندازی دستگاه اسپکتروفتومتر و وصل آن به برق، باید از UPS یا ثابت کننده جریان و محافظ برق استفاده نمود.

بعد از روشن شدن دستگاه، حداقل زمان لازم برای پایداری دستگاه ۱۵ دقیقه می باشد. پس از این مدت دستگاه گرم شده و به پایداری حرارتی و الکترونیکی می رسد و برای استفاده آماده می باشد.
از ریختن نمونه در داخل سل هولدر و روی دستگاه خودداری نمایید. همچنین پس از استفاده از دستگاه، باید دستگاه و سل های مربوطه را تمیز و روی دستگاه کاور کشید.

 

 

انواع دیگر اسپکتروفتومتر ها

 

اسپکتروفتومتر ها به دو دسته تقسیم می شوند : تک پرتو و دو پرتو.

اسپکتروفتومتر های تک پرتو اولین نسل اسپکتروفتومتر ها بوده و تمام نور از بین نمونه عبور می کند، در این نوع برای اندازه گیری شدت نور تابشی باید به این نکته توجه داشت. این اسپکتروفتومتر ها ارزان هستند چرا که بخش های کمتری داشته و سیستم آنها پیچیدگی کمتری دارند.

نسل جدید اسپکتروفتومتر ها نوع دو پرتو است. در این نوع نور قبل از این که به نمونه برسد به دو پرتو مجزا تفکیک می شود که این مسئله یک امتیاز تلقی می شود زیرا خواندن منبع و نمونه به طور همزمان انجام می شود. در برخی از اسپکتروفتومتر های دو پرتو، دو آشکارساز وجود دارد بدین ترتیب امکان اندازه گیری همزمان پرتو های نمونه و مرجع فراهم می شود.

سایر اسپکتروفتومتر های دو پرتو، که تنها یک آشکارساز دارند از برشگر پرتو استفاده می کنند که این وسیله در هر لحظه یک پرتو را سد کرده و آشکارساز اندازه گیری پرتو نمونه و مرجع را به صورت یک در میان انجام می دهد.

 

 

نور از بسته های بسیار کوچکی به نام فوتون تشکیل شده است که انرژی هر یک از آنها به محض برخورد به یک الکترون منتقل می شود. تنها هنگامی انتقال رخ می دهد که انرژی فوتون ها برابر با انرژی مورد نیاز برای انتقال الکترون به لایه انرژی بعدی باشد.

این پروسه که در آزمایش های محاسبه کیفیت و کمیت DNA موجود در محلول ها استفاده می شود، پایه طیف بینی جذبی را تشکیل می دهد. به طور کلی نور با طول موج و انرژی خاص به نمونه تابانده شده و مقدار مشخصی از انرژی آن جذب می شود.

سپس با اندازه گیری انرژی رد شده از نمونه توسط یک فوتودتکتور، مقدار جذب تعیین می شود. اسپکتروفتومتر دستگاه پیچیده ای است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. در این دستگاه نور توسط یک منبع نور تولید شده و پس از گذشتن از میان نمونه مورد نظر نور، به صورت طیفی منتشر می شود سپس به وسیله سنسور ها آشکارسازی شده و به صورت نتایج قابل کاربردی ترجمه می شود.

خروجی اسپکتروفتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. داده هایی که برای تولید نمودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طول موج ذخیره می شود. مقدار گراف بیان کننده مقدار عبور یا مقدار جذب است. اسپکتروفتومتر های امروزی دیجیتالی بوده و به وسیله میکروپروسسور کنترل می شوند.

 

نور مرئی

محدوده نور مرئی حدود ۷۰۰-۴۰۰ نانومتر است. اسپکتروفتومتر های ناحیه مرئی دقت و صحت متغیری دارند. برخی از آنها آشکارساز CCD با پیکسل های کافی برای قرائت هر nm10 را دارند، در حالیکه برخی دیگر می توانند در هر نانومتر چندین قرائت انجام دهند. این اسپکتروفتومتر ها می توانند از منابع نور سیمابی، هالوژن، LED یا ترکیبی از این منابع مثل LED تقویت شده با رشته های تنگستن استفاده کنند.

 

نور ماورا بنفش

اسپکتروفتومتر هایUV علاوه بر اینکه در طیف سنجی مایعات بسیار متداول است، برای گاز ها و همچنین جامدات نیز استفاده می شود. نمونه را در محفظه مستطیلی مخصوص که معمولا یک سانتیمتر پهنا دارد قرار می دهند. این محفظه که کاوت(Cuvvette) نامیده می شود می تواند شکل پلاستیک، شیشه یا کوارتز داشته باشد. پلاستیک و شیشه، UV را جذب می کنند از اینرو تنها می توان آنها را برای اسپکتروفتومتر های نور مرئی استفاده کرد.

 

نور مادون قرمز

اسپکتروفتومتر مادون قرمز در شناسایی مولکولی و ارتعاشات وابسته به ساختار آن استفاده می شود. ساختار های شیمیایی متفاوت، به دلیل تفاوت در انرژی های مربوط به هر طول موج، راه های مختلفی در پاسخ به طول موج های مختلف دارند.

به عنوان مثال مادون قرمز های برد متوسط، تمایل به لرزش دورانی دارند، در حالیکه مادون قرمز نزدیک(با انرژی بالا) تمایل به لرزش هارمونیک مولکولی مانند جنبش دارد. در اسپکتروفتومتر های IR متداول یک پرتو مادون قرمز مستقیما به نمونه می تابد و تمام طول موج های طیف نسبت به پرتو مرجع اندازه گیری می شود.

به منظور تولید طیفی با کیفیت بالا، باید پهنای طیف ورودی به آرامی اسکن شود. اسپکتروسکوپی IR با روش بسط تبدیل فوریه اصلاح می شود. قلب اسپکتروفتومتر های IR، تداخل سنج میشلسون است. نور تابش شده از منبع IR به سمت سلول های نمونه هدایت می شود.

نیمی از پرتو تابشی از آینه ثابت باز تابیده شده و نیم دیگر آن از آینه ای که مرتبا در فاصله ای حدود ۵/۲ میکرومتر حرکت می کند منعکس می شود. هنگامی که دوباره دو پرتو در آشکارساز با هم ترکیب می شوند و تداخل به وجود می آید، حدود دو ثانیه یک اسکن از فاصله ورودی گرفته شده و در کامپیوتر ذخیره می شود. به همین ترتیب چندین اسکن دیگر نیز به طور همزمان به آن اضافه می شود.

با توجه به نوسانات و ارتعاشات حرارتی در آزمایشگاه بدیهی است که این امر ناممکن است. پس به منظور حل این مشکل از لیزر هلیم-نئون برای تاباندن به تداخل سنج میشلسون استفاده می شود و تداخل لیزر به عنوان فرکانس مرجع به کار گرفته می شود. کارائی FTIR از دستگاه های معمولی بیشتر است که می توان تنها با مقدار کمی از نمونه و در زمانی کوتاه به طیفی عالی دست یافت.

 

در هنگام نصب دستگاه اسپکتروفوتومتر باید به نکات زیر توجه داشت:

۱- اسپکتروفوتومتر باید روی سطحی سفت و‌ در محیطی خشک و تمیز نصب شود.‌

۲- به جهت امکان جریان هوا در اطراف اسپکتروفوتومتر ، باید بین دستگاه و دیوارهای اطراف ۵۰ میلیمتر فاصله باشد.‌

۳- کابل برق دستگاه به پریز گراند شده با ولتاژ مناسب وصل شود.‌

۴- پس از اتصال آداپتور‌AC‌ به برق، خروجی آن باید به گونه ای به دستگاه وصل شود که منبع ذخیره‌DC‌ در مسیر آن قرار گیرد.‌

۵- در صورتی که خود دستگاه فاقد پرینتر است، باید از طریق پورت مخصوص آن‌را به پرینتر وصل کرد.‌

۶- پس از روشن کردن دستگاه مدتی صبر کرده تا دستگاه گرم شده و به پایداری حرارتی و الکترونیکی برسد.‌

 

 

 

دستگاه اسپکتروفتومتر چیست؟ / کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر در آزمایشگاه