استخراج DNA با استفاده از روش فنول کلروفرم بهترین روش استخراج DNA
مواد مورد استفاده:
فنول ، کلروفرم، Lysis،،آمونیوم استات،اتانول ۱۰۰,۷۰%، Protenas K، Solvent
لوله فالکون حاوی فنول باید درون دمای یخچال و به صورت ایستاده قرار گرفته باشد(چون حاوی دو فاز می باشد و نباید دو فاز با هم مخلوط شوند.فاز زیرین حاوی ترکیب فنول و فاز رویی حاوی Tris جهت جلوگیری از اکسیده شدن محلول فنول می باشد).از قبل محلولی جهت لایز کردن دیواره سلولی آماده کردیم(از ترکیبی از موادTris 10mµ ۰٫۱۲۱۱gr , EDTA 0.1µ ۳٫۷۲۲ gr , SDS 0.5% با D.Wبه حجم ۱۰۰ml رساندیم.جهت اینکه این مواد خوب در محلول حل شوند مقداری ورتکس کردیم و به مدت ۱۵minدر دمای ۵۰ درجه سانتی گراد دستگاه فور گذاشتیم).مراحل انجام کار چه افزودن و چه برداشتن محلول در این روش زیر هود انجام می گیرد.
۱۰۰µlاز Buffy coatکه قبلا آماده کردیم را درون میکروتیوپ ۲ml می ریزیم، بعد ۴۰۰µl از محلول lysis که قبلا آماده کردیم را به آن اضافه و ۳تا ۶ ثانیه ورتکس تا خوب در هم حل شوند بعد ۱۰ ثانیه میکروفیوژ میکنیم تا محلولی که به دواره و در میکروتیوپ چسبیده به قسمت پایین میکروتیوب بیاید،در مرحله بعد به مدت یک ساعت میکرو تیوب ها را در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد Dry-block قرار میدهیم تا محلول حاوی لایزز بتواند دیواره سلولی را باز کرده و محتویات سلولی را در دسترس قرار دهد.بعد از زمان مورد نظر به هر میکروتیوب ۲ µlاز Protenas K اضافه،۳ تا ۴ ثانیه ورتکس و بعد ۱۰ ثانیه میکروفیوژ و بعد به مدت ۳ساعت میکرو تیوب ها را در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد Dry-block قرار میدهیم تا Protenas K درون محلول بتواند DNAدرون هسته را جدا می کند.داخل یک بشر ۵۰ml محلول ویست ۱۰%جهت غیر فعال کردن مواد و محلول های اضافی درست میکنیم(شامل ۱۰mlاز محلول وایتکس و۹۰mlآب)در مرحله بعد چون مواد و ناخالصی های درون محلول(شامل دیواره های سلولی) زیاد شده هم حجم محلول درون میکروتیوب از محلول فنول اضافه و ۱۰ ثانیه ورتکس انجام می دهیم و بعد هم حجم فنول به محلول کلرو فرم(باید در دمای یخچال نگهداری شود) اضافه می نماییم و مجددا ۱۰ ثانیه ورتکس میکنیم و بعد ۱۵min با دور ۱۴۰۰۰rpm در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانترفیوژ(یخچال دار) می نماییم.در این مرحله فنول باعث جدا سازی هیستون ها و پروتئین ها از DNAشده و آن را خالص و عاری از هر ناخالصی می کند،نباید زیاد فنول را درون محلول نگه داشت زیرا باعث میشود که به خود DNA هم آسیب برسد،کلروفرم هم باعث می شود که فاز آلی و آبی از هم جدا شوند، فاز آلی که در پایین میکروتیوب قرار می گیرد شامل فنول ،کلروفرم، و مواد اضافی و جدا شده از DNA(دیواره سلولی و پروتئین ها) می باشد. فاز رویی هم شامل آب و DNA می باشد،بعضی از میکروتیوب ها هم یک رینگ بین فاز آلی و فاز آبی تشکیل می دهند شامل پروتئین جدا شده از DNA می باشد که این رینگ به رنگ شیری کدر از دو فاز قابل تمایز می باشد.
باید به آرامی میکروتیوب ها را از درون دستگاه سانترفیوژ خارج کرد که فاز ها با هم مخلوط نشوند،بعد زیر هود فاز رویی را درون یک میکروتیوب دیگر میریزیم (به هیچ عنوان نباید رینگ حاوی پروتئین بین دو فاز به فاز آبی به میکروتیوب جدید منتقل شود زیرا در مرحله آخر مشاهده باند اسمیر فراوان مانع دیدن باند می گردد).فاز زیری(فاز آلی)را درون ظرف ویست که از قبل آماده کردیم میریزیم تا اگر DNA یا مواد دیگر در آن باشد غیر فعال شوند. در صورتی که محلول آبی که جدا کردیم کدر باشد یک بار دیگر مرحله قبل را تکرار(یعنی هم حجم این محلولی که داریم کلروفرم اضافه میکنیم تا ضایعاتی که درون محلول مانده جدا کند و مجددا فاز رویی را درون یک میکروتیوب دیگر می ریزیم.در این مرحله دیگر نیازی به افزودن فنول نیست،فقط کلروفرم اضافه و مراحل را انجام می دهیم).
در مرحله آخر جدا کردن فاز آبی میزان دقیق فاز آبی را با کشیدن با سمپلراندازه میگیریم،بعد به اندازه ۰٫۲ درون هر میکروتیوب که جدا کردیم استات آمونیوم ۱۰ µ اضافه و دو برابر حجم اتانول ۱۰۰% اضافه میکنیم .در این مرحه وقتی حلال آب باشه چون قدرت یونی نسبتا بالایی داره مولکول های اسیدنوکلئیک (گروه های فسفات باردار) با آب واکنش میدن و خوب در آب حل می شوند (به همین جهت با محلول های آلی میشود اسید نوکلئیک را از بقیه ی اجزای سلولی جدا کرد). وقتی اتانول به محلول اضافه میشود قدرت یونی حلال کم و تمایل اسید نوکلئیک هم به حلال کم و با یون های موجود در محیط(در اینجا استات آمونیوم) واکنش و سنگین میشود و رسوب می کند. نباید در این مرحله با دستگاه ورتکس محلول را بهم زد زیرا رشته های DNA شکل گرفته و در صورت ورتکس آنها تیکه تیکه می شوند و برای همین باید به آرامی بین انگشتان دست به مدت ۱۰ دقیقه میکروتیوب ها را تکان داد تا خوب محلول حل شود در این مرحله میتوان بار اول تکان دادن میکروتیوب ، با چشم غیر مسلح رشته های DNA که با ترکیب آمونیوم استات ضخیم شده اند را مشاهده نمود.بعد میکروتیوب ها را جهت آبگیری هر چه بهتر اتانول به مدت حداقل یک ساعت درون فریزر با دمای -۲۰ قرار داد که ما در این مطالعه به مدت ۱۶ ساعت این مرحله را انجام می دادیم در صورتی که خوب اتانول با محلول حل نشده باشد محلول دچار یخ زدگی میشود زیرا اتانول عمل آبگیری را انجام می دهد.بعد از این مرحله میکرو تیوب ها نباید دچار یخ زدگی شده باشند،در صورت یخ زدگی باید منتظر ماند تا در دمای محیط یخ آنها باز شود و بعد در دستگاه سانتر فیوژ با دور ۱۴۰۰۰rpm و زمان ۱۵min و دمای ۴درجه سانتی گراد سانترفیوژ را جهت رسوب DNAانجام می دهیم،در این مرحله مثل مراحل قبل یک ظرف حاوی محلول ویست آماده می نماییم،بعد از اتمام سانترفیوژ محلول را به صورت یکدفعه درون ظرف ویست خالی میکنیم و آن را بر میگردانیم در مرحله بعد به هر میکروتیوب حاوی رسوب DNA به اندازه مجموع حجم Buffy Coat اولیه و مححلول لیزیز که جمعا ۵۰۰mlشده بود الکل ۷۰% اضافه میکنیم و به آرامی ۳تا ۶ ثانیه ورتکس میکنیم تا رسوب DNAدرون الکل حل شود .سپس با دور ۱۴۰۰۰rpm، دمای ۴درجه سانتی گراد،۱۰min سانترفیوژ می کنیم.بعد از سانترفیوژ محلول را دروز ضرف ویست خالی میکنیم و روی گاز استریل میکروتیوب ها را برمیگردانیم تا قطرات الکل باقی مانده خالی شود بعد میکرو تیوب ها را در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد Dry-block قرار میدهیم تا قطرات الکل از میکرو تیوب بخار شوند،جهت فهمیدن اینکه الکل کامل از میکروتیوب کامل بخار شده یا نه میکروتیوب رو روبروی چشممان میگیریم و و با انگشت به آرامی به ته میکرو تیوب ضربه میزنیم که اگه قطرات ریزی مانده باشده مشخص می شود.بعد از تبخیر کامل الکل از میکرو تیوب ها به ازای ۱۰۰mlاز Buffy Coat اولیه به هر میکروتیوب ۲۰ µl از محلول Solvent کیت DNPTM اضافه و بعد میکروتیوب ها را به آرامی ۳تا ۶ ثانیه جهت حل شدن DNAدرون Solvent به آرامی ورتکس می کنیم بعد ۲ دقیقه میکروتیوب ها را در دمای ۳۷ درون Dry-block جهت بهتر حل شدن DNA قرار می دهیم و سپس میروتیوب های حاوی محلول DNAرا به درون فریزر با دمای -۲۰ درجه سانتی گراد جهت انجام PCR قرار می دهیم. حداقل باید یک ساعت نمونه جدا شده DNAدرون فریزر بماند و بعد PCR انجام شود.
منبع:سایت جامعه ی دانشجوایان بیوتکنولوژی